CLONACIÓN DE UN FRAGMENTO DE DNA:
0) INTRODUCCIÓN
La clonación del DNA puede definirse como la recombinación in vitro de un fragmento de DNA con un DNA vector con capacidad de replicación autónoma. El fragmento de DNA se replicará junto con el DNA vector en la célula hospedadora y así será posible obtenerlo en un número elevado de copias.
Las etapas básicas son:
1) Extracción y fragmentación específica del DNA del organismo que nos interesa.
3) Introducción en las células receptoras del DNA recombinante.
4) Selección de colonias aisladas que porten moléculas de DNA recombinante.
La clonación nos ha abierto las puertas al estudio y aislamiento de genes, algo que hace unos años era imaginable. Además de permitirnos la identificación de enfermedades genéticas las técnicas de DNA recombinante nos han abiertos nuevas puertas terapéuticas.
Esquema clonación DNA.
La preparación del DNA va a depender del organismo del que proceda.
El DNA podrá obtenerse mediante la extracción a partir de la célula, generalmente con la finalidad de construir una genoteca.
Básicamente consiste en una lisis celular y la purificación del DNA, con la finalidad de que este resulte libre de contaminantes. La lisis puede conseguirse mediante métodos físicos y químicos.
La pared bacteriana se degrada mediante un lisozima y se lisa con EDTA y SDS. Posteriormente las proteínas y el RNA se degradan por tratamiento con proteasas (ej: Kinasa K) y con RNAasas. El DNA se podrá separar de los enzimas y los restos ya que precipitará con etanol.
Este DNA purificado, en el que está representado todo el genoma del individuo lo vamos a fragmentar con el objetivo de construir lo que denominamos genotecas.
Antes por tanto tendremos que fragmentar el DNA.
FRAGMENTACIÓN DEL DNA, ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.
Las endonucleasas de restricción son enzimas que se encuentran en numerosas especies bacterianas y su función es la de reconocer y cortar el DNA foráneo. El DNA de la propia célula no se corta y esto es porque la la secuencia que reconocería el enzima se encuentra metilada y por tanto no podrá actuar. El conjunto formado por la metilasa y la endonucleasa es lo que se denomina sistema de modificación- restricción. Aunque los enzimas varían en algunos aspectos de sus condiciones de actuación, se ha observado que todos ellos requieren Mg y actúan a un Ph óptimo de entre 7.2 y 7.8.
Existen tres tipos de endonucleasas, que identificamos con la abreviatura de tres letras correspondientes a la especie bacteriana de la que proceden.
Las del Tipo I cortan de forma inespecífica en un punto que dista de la secuencia de reconocimiento alrededor de 1000 pares de bases.
Las de Tipo III, aunque también es bastante inespecífica, corta en un punto más cercano de la secuencia que las del tipo I, a unos 25pb.
Tanto la una como la otra requieren energía a partir de ATP.
Las endonucleasas de tipo II son las más utilizadas. No requieren ATP y cortan específicamente en la secuencia de reconocimiento.
Estas secuencias del DNA de doble hebra tienen entre 7/9 pb y son secuencias palindrómicas o invertidas. Aunque estas secuencias son específicas algunas endonucleasas reconocen secuencias incluidas en secuencias de reconocimiento de otros enzimas. Por ejemplo, la Sau 3 AI reconoce la secuencia GGATCC, la cual está incluida en la secuencia de reconocimiento de la Bam HI, GGATCC. Los extremos resultantes serán por tanto compatibles. En el caso de que ambas enzimas reconozcan la misma secuencia, estos enzimas se denominarán isoesquizómeros. Estos pueden cortar en distintos puntos de la secuencia o pueden diferenciarse en que uno de ellos es sensible y el otro no a las metilaciones.
A su vez, los fragmentos obtenidos podrán ser extremos romos, si cortan ambas cadenas en el centro de la secuencia, o cohesivos, si cortan enlaces separados unos pocos nucleótidos en cada cadena complementearia.
Una vez que se ha fragmentado el DNA, podemos separar el fragmento que nos interesa mediante una electroforesis en gel de agarosa. Sin embargo debido a la digestión obtendremos numerosos fragmentos de distintos tamaños donde también influirá el tiempo que hemos dejado al enzima para que actúe. Por ello es mucho más práctico construir, antes de clonar nuestro fragmento, una librería de DNA.
Por último decir que en la actualidad, mediante programas de ordenador podemos situar todos los posibles puntos de corte de enzimas de restricción, obteniendo así lo que se denomina mapa de restricción.
GENOTECAS
Una librería de DNA es una colección de los fragmentos derivados del genoma de un organismo.
El paso previo va a ser la purificación y la digestión parcial del DNA mediante los métodos descritos. Una vez fragmentado lo sometemos a un proceso de separación como por ejemplo utilizando una centrifugación en gradiente de sacarosa, con el objetivo de eliminar los fragmentos pequeños.
Obtendremos al final una población de bacterias o bacteriófagos siendo cada una de ellas portadoras de distintos DNA recombinantes.
Este tipo de librerías es la denominada librería genómica. El problema con estas librerías es que es que la mayor parte del DNA genómico es no codificante por lo que la mayor parte de nuestros fragmentos contendrán intrones.
Por lo tanto es mucho más efectivo construir una librería de cDNA o DNA complementario. En los clones de cDNA no hay secuencias intrónicas ya que se han eliminado debido al proceso de maduración que sufre el mRNA primario. Por ello contienen una secuencia codificante continua. La síntesis de cDNA se realiza en dos etapas :
-Síntesis de DNA de una hebra a partir del mRNA con la transcriptasa inversa.
-Síntesis de la hebra complementaria mediante la DNA polimerasa.
La extracción del RNA sigue el mismo protocolo que la extracción del DNA: lisi, eliminación de las proteínas de SDS y fenol.
Hay que eliminar de forma rápida las RNAasas y para ello se utilizan inhibidores como el DEPC ( dietilpirocarbonato), que modifica el RNA por carboximetilación.
Una vez que ya tenemos los RNAs purificados tenemos que separar los mRNAs que sólo constituyen un pequño % del RNA total. Para ello realizamos una cromatografía en oligo T- celulosa o en poliU- sefarosa. Los mRNAs se retendrán gracas a la cola de poliA que presentan en el extre 5`.
Para separar un tipo determinado de mRNA lo podemos hacer mediante la técnica de inmunoprecipitación de los polisomas durante la traducción in vitro.
El problema que había antes con las transcriptasas inversas que se utilizaban, del virus AMV, es que poseçia actividad RNAsa por lo que se obtenían fragmentos muy pequeños. A los enzimas que se utilizan en la actualidad se les elimina el extremo carboxilo terminal, que es dondo sem encuentra la actividad RNAsa.
La transcriptasa inversa requiere un cebador. Este puede ser un oligo T que será complementario a la cola de poli A o si conocemos la secuencia podemos sintetizart in vitro un cebador complementario. De esta forma nuestro cDNA tendrá sólo la secuencia codificadora.
Una vez que tengamos nuestro RNA-DNA tenemos que eliminar el RNA para sintetizar la otra hebra con la polimerasa I. La horquilla que nos queda en el extremo 3` habrá que eliminarla con una nucleasa como la S1.
Es importante que en el caso de que sinteticemos la genoteca a partir de la proteína, tener en cuenta que el código genético es degenerado; es decir, que un aminoácido puede ser codificado por más de un triplete de bases.
Otro uso de la construcción de las librerías de cDNA es la de poder definir diferencias de expresión génica entre dos tipos celulares muy parecidos. Se denomina “ Hibridación substractiva”. Obtenemos el mRNA de la proteína que nos interesa en un tipo celular y obtenemos su cDNA. Este cDNA lo hibridamos con exceso de mRNA del segundo tipo celular. El hecho de que no se hibriden implica que esta proteína solo se sintetiza en uno de los tipos celulares. Este método se utilizó por primera vez identificando proteínas receptoras de membrana que estaban en los linfocitos T y no en los B.
Por último con respecto a otros tipos de genotecas tenemos por ejemplo la genoteca específica de cromosomas. Los cromosomas los obtenemos mediante una citometría de flujo. Con este método los separamos en función de la proporción de bases A/T. Obtendremos una genoteca que tiene el DNA de un determinado cromosoma.
Una vez que ya tengamos nuestra librería tendremos que aislar el fragmento que queremos clonar de entre todos los segmentos representados en la misma. Nuestro fragmento podrá ser identificado mediante su hibridación mediante una secuencia de DNA marcada y complementaria, lo que se denomina sonda.
Las sondas pueden construirse de varias formas, dependiendo de la información que tengamos acerca del gen. Si la proteína de interés ha sido identificada, a partir de su secuencia de aminoácidos podremos sintetizar fragmentos complementarios, eso sí, teniendo en cuenta los distintos tripletes para cada aminoácido.
Si disponemos por ejemplo de anticuerpos que reconozcan la proteína que codifica el gen podemos identificar el clon que esté sintetizando esa proteína. Del mismo modo, si la proteína es receptora, podremos utilizar una molécula que actúe como ligando. Para estos dos métodos es necesario que al construir la librería hayamos utilizado un vector que permita la síntesis de proteínas codificadas por el DNA exógeno, lo que se denominan vectores de expresión.
Las sondas de DNA pueden ser de una o doble hebra. Las de una hebra tienen la ventaja de que no se van a formar híbridos compuestos por dos sondas autohibridadas.
Estas sondas tendrán que ser marcadas, marcaje que ha sufrido grandes avances desde los años setenta. Hasta los ´70 se utilizaban métodos radioactivos pero a partir de este año que se desarrollaron nuevas técnicas como el marcaje enzimático y el marcaje químico.
El marcaje enzimático puede ser terminal o interno. Un ejemplo de marcaje interno es el de Nick Translation o desplazamiento de mella. En este método se participan una DNAsa y una DNA polimerasa. La DNAsa hidrolizará enlaces fosfodiester dando lugar a mellas al azar. Los extremos 5´fosfato permiten que actúe la DNA polimerasa. Esta con su actividad exonucleasa 5´- 3´ eliminará nucleótidos del extremo 5´, y con su actividad polimerasa 5´- 3´ añadirá nuevos nucleótidos marcados. Por tanto, el resultado final es la sustitución de nucleótidos no marcados por nucleótidos marcados.
Una vez que tenemos sintetizada nuestra sonda de DNA podremos utilizarla para localizar el clon que contiene nuestro gen. Para ello realizamos una hibridación in situ aprovechando las interacciones que se establecen entre bases complementarias. Transferimos mediante un papel de filtro miembros de cada colonia bacteriana que hemos cultivado en la placa. Este proceso es lo que se denomina “blotting”. A estos miembros de las distintas colonias que se han adherido al papel, réplicas, se les somete a un proceso de lisis celular y desnaturalización. Posteriormente se les añade la sonda que hemos sintetizado, por ejemplo una sonda marcada radioactivamente. Mediante una autorradiografía podremos detectar las colonias que contienen nustro fragmento de DNA.
AMPLIFICACIÓN DEL GEN MEDIANTE PCR.
La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica que nos permite obtener artificialmente múltiples copias de nuestro fragmento de DNA, ahorrándonos todos los procesos descritos anteriormente.
Este proceso requiere:
Dos cebadores.
Una DNA polimerasa termoestable, la más utilizada es la Taq.
Nucleótidos de DNA.
DNA que queremos amplificar.
Una vez desmaturalizado nuestro DNA añadimos ambos cebadores que hibridarán uno con cada hebra. La DNA polimerasa entonces podrá sintetizar las hebras complementarias. Estas hebras sintetizadas servirán como molde para el ciclo siguiente y así sucesivamente.
A medida que se repiten los ciclos los productos de DNA unidos a los cebadores se amplifican en proporciones geométricas: 2,4, 8, 16…
Las ventajas de esta técnica son varias. En primer lugar, requiere pequeñas cantidades de DNA. Además el proceso es mucho más rápido.
Sin embargo para poder realizarlo es necesario conocer la secuencia para sintetizar los cebadores. Por otro lado es muy fácil contaminar el DNA y es complicado aplicarlo a secuencias de más de 1kb
Por último decir que la PCR puede utilizarse para amplificar cDNA a partir de RNA, lo que se denomina como RT- PCR. Ésta técnica requiere un primer ciclo con la transcriptasa inversa. Por tanto, mediante la técnica del PCR se pueden amplificar genotecas tanto genómicas como de cDNA
2) UNIÓN DE LOS FRAGMENTOS DE DNA A NUESTRO VECTOR.
Por lo tanto ya tenemos DNA aislado, hemos fragmentado el DNA de nuestro vector y queremos insertar en él nuestro gen, con el objetivo de clonarlo.
Vectores de clonación.
Un vector es una molécula de DNA con un origen de replicación autónomo y que posee zonas donde pueden introducirse fragmentos de DNA exógeno. Así, el DNA exógeno se replica como parte del vector en la célula receptora y hospedadora.
Plásmidos.
Moléculas de DNA bihebra circular extracromosómico que se heredan de manera estable. Suelen conferir a la célula que hospedan alguna característica fenotípica como la resistencia a antibióticos. Están clasificados en dos grupos: estrictos, si su replicación está acoplada a la del DNA de la célula hospedadora; y relajados, si se replican independientemente.
Para ser utilizados como vectores los plásmidos deben cumplir unas características: pequeño tamaño (mejor manipulación y aislamiento); replicación relajada (permite obtener el DNA clonado en grandes cantidades); y presencia de puntos de corte únicos (permiten seleccionar las células que porten el plásmido recombinante).
Plásmidos con origen de replicación en bacterias
El plásmido bacteriano más ampliamente usado es el pBR322 (plásmido de Bolívar y Rodríguez), éste posee un origen de replicación en E.coli multicopiativo o relajado, un tamaño pequeño y posee 20 sitios de corte únicos para enzimas de reestricción de los cuales 6 se encuentran dentro del gen de resistencia a la tetraciclina, otros dos dentro de su promotor y tres dentro del gen de resistencia a la ampicilina. De modo que las células de E.coli que porten este plásmido serán resistentes a ambos antibióticos mientras que las que porten un plásmido recombinante serán sensibles a aquel antibiótico en cuyo gen se ha producido la inserción de DNA exógeno y resistentes al otro. Así resulta sencilla la selección de bacterias transformadas con el plásmido recombinante.
Plásmido pBR322 mostrando algunos sitios de restricción útiles para la clonación.
Para esta selección por resistencia a antibióticos se han desarrollado plásmidos que permiten la selección directa en un solo medio como los que tienen junto con un gen de resistencia a un antibiótico el fragmento lacZ' suficiente para completar la selección del operon lac de E.coli que codifica para la βgalactosidasa. En el lacZ' se ha creado un sitio de clonaje múltiple, pequeña zona de DNA donde están presentes sitios de corte únicos de varias enzimas de restricción en los cuales se introduce el DNA exógeno.
La serie de plásmidos pUC son tratados en un medio con IPTG (inductor de la síntesis de β-galactosidasa en E.coli), ampicilina y X-gal, lo que les hace dar lugar a colonias resistentes al antibiótico y de color azul (se rompe el X-gal) pues producen β-galactosidasa funcional. El más representatico es el pUC19, que lleva un origen de replicación en Escherichia coli y el gen de resistencia a la ampicilina.
Plásmido pUC19.
Plásmidos con origen de replicación en levaduras.
Las levaduras son las eucariotas más utilizadas como vectores por el pequeño tamaño de su genoma y su corto ciclo celular lo que les hace fácilmente manejables. Y además, casi todas las levaduras son aptas para el consumo humano lo que las hace muy buenas candidatas para la producción a nivel industrial de proteínas heterólogas.
La gran mayoría de este tipo de vectores son lanzadera o shuttle lo que significa que poseen además de un origen de replicación y un gen que permita la selección en la levadura, un origen de replicación y un gen que permita la selección y amplificación en E.coli.
El gen lacZ también se expresa en levaduras, habiéndose construido plásmidos lanzadera especialmente útiles para la clonación y estudio del funcionamiento de promotores en levaduras.
Los plásmidos más importantes de este tipo son los YACs, que contienen secuencias teloméricas en ambos extremos. Permiten clonar fragmentos muy grandes, de 150 a 1000kb, siendo utilizadospara el genoma humano o de eucariotas superiores
Virus y bacteriófagos.
Se utilizan virus y bacteriófagos como vectores porque su rendimiento de infección es superior al que se obtiene en la transformación con plásmidos aunque su manipulación es más compleja. Los vectores virales admiten y replican de manera estable insertos mayores que los plásmidos. La infección viral permite que cada célula hospedadora contenga muchas copias del gen exógeno y que éste se exprese abundantemente bajo el control de los promotores de los virus que son muy activos.
El bacteriófago más conocido es el λ de E.coli, cuyo genoma consta de un DNA bihebra de 50kb de tamaño y que presenta en sus extremos 5', 12 nucleótidos monohebra con secuencias complementarias denominados extremos cos, que, al emparejarse, permiten que la molécula se circularice al introducirse en la célula hospedadora y así se pueda también empaquetar el DNA dentro de la cápsida viral.
La parte central del DNA del bacteriófago sirve para asegurar su integración en el cromosoma de la bacteria hospedadora durante la fase lisogénica pero no es indispensable para la replicación del virus y, por tanto, puede ser interrumpida o sustituida y eliminada por el DNA exógeno a clonar. Si no es sustituido el DNA no esencial por el DNA exógeno no se produce el empaquetamiento dado el pequeño tamaño de la molécula de DNA resultante, lo que se utiliza para seleccionar fagos recombinantes.
Cósmidos y fagémidos.
Los cósmidos son vectores híbridos desarrollados por combinación de plásmidos y del genoma del fago λ. Constan de una molécula de DNA de 5kb que lleva genes de resistencia a antibióticos, el origen de replicación de un plásmido bacteriano, los extremos cos del DNA del fagoλ y sitios únicos de restricción para la inserción del DNA a clonar. Los cósmidos recombinantes pueden empaquetarse in vitro en partículas de fago para infectar las células hospedadoras en las que el DNA se inyecta y circulariza como fago pero se replica como plásmido. La selección de bacterias se hace, por eso, por resistencia a antibióticos. Los fragmentos de DNA clonados pueden ser muy grandes, de hasta 47kb por lo que son adecuados para la construcción de genotecas eucarióticas.
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Representación
de un cósmido.
Los fagémidos son plásmidos bacterianos unidos a un origen de replicación de un fago de DNA monohebra. Sin embargo, permiten obtener el DNA de cada hebra por separado con un fago auxiliar
Elementos trasponibles.
También llamados trasposones. Son secuencias de DNA móviles que son capaces de insertarse en otras zonas del genoma y cambiar genes de lugar. Los más sencillos se denominan secuencias de inserción o IS y su longitud aproximada es de 1kb. Codifican una nucleasa específica o transposasa y poseen secuencias repetidas invertidas en ambos extremos de unos 20pb. Después de la transposición, la secuencia receptora (4-12pb) aparece duplicada pero no invertida a ambos lados de la IS. El mecanismo de la transposición se basa en la unión de las secuencias repetidas invertidas de los extremos de la IS a su propia transposasa que va haciendo cortes en bisel en las zonas de los DNAs donante y receptor de la IS. La transposición puede ser conservativa si sólo interviene una copia del transposón o replicativa si el transposón se duplica al desplazarse. La secuencia receptora es diferente para cada inserción por lo que los transposones se insertan en regiones inespecíficas del genoma
No sólo se han encontrado elementos transponibles en bacterias sino también en organismos eucariotas, en donde son más abundantes los retrotransposones en los que la transposición ocurre mediante un intermediario de RNA.
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Mecanismo simplificado de la integración de una secuencia de inserción en un DNA receptor.
Fusión del vector con el segmento de interés:
Para unir los fragmentos de DNA al vector utilizamos las DNA ligasas.
Para ello hay que tener en cuenta los extremos que se nos han originado a partir de la acción de los enzimas de restricción. Como hemos dicho antes los extremos pueden ser cohesivos y romos ( en donde la eficacia es menor), ya que la unión de los extremos cohesivos se ve facilitada por las secuencias complementarias que se van a poder aparear.
Sin embargo, mientras que el DNA de extremos romos se puede unir a cualquier otro DNA de extremos romos, en el caso de la unión de extremos cohesivos, es necesario que éstos sean compatibles. En el caso de que esto no sea así podemos convertir un tipo de de sitio para un enzima en otro distinto; es decir, que podemos convertir los extremos cohesivos en romos.
Tendremos que distinguir dos casos. En primer lugar, que los extremos sean 5` por lo que utilizaremos la DNA polimerasa. Por otro lado, que los extremos sean 3`, en tal caso lo tratamos con la nucleasa S1.
Otra forma de volver compatibles los extremos de DNA es a través de la utilización de adaptadores o linkers. Éstos son oligonucleótidos sintéticos de doble hebra con extremos romos y que presentan un sitio de corte específico para un enzima de restricción. Esto permite que una vez que actúe el enzima se generen extremos cohesivos complementarios a los del vector. Además estos adaptadores nos permiten que una vez que tengamos el clon podremos recuperar nuestro fragmento y también que al insertar nuestro cDNA éste lo haga en la orientación adecuada.
Con el uso de DNA ligasas hay que evitar en primer lugar que el DNA del vector no se recircularice y para ello se eliminan los fosfatos del extremo 5` mediante la fosfatasa alcalina.
Dentro de las ligasas más utilizadas están la T4 que requiere ATP y se utiliza con extremos romos, y la ligasa de E. Coli que requiere NAD.
Otro método de unión aparte de las ligasas es la unión mediante colas homopoliméricas. Consiste en añadir colas hmopoliméricas, como poliC y poliG a los extremos de inserto y al vectror. Ambas moléculas se unirán por apareamiento.
En el caso de que el DNA que queremos insertar sea producto de la PCR, los extremos no son exactamente romos sino que tienen una protuberancia 3`A, por lo que habrá que tratarlos con la S1 o con la polimerasa. Actualmente se comercializan plásmidos con extremos protuberantes T por lo que los extremos serán complementarios.
3) INTRODUCCIÓN DEL DNA EN CÉLULA HUÉSPED: TRANSFORMACIÓN.
Cuando el DNA exógeno ha sido ligado en el vector, debe entonces introducirse en la célula hospedadora. Las más usada es E. coli pues, o bien la clonación se realiza directamente en esta bacteria o bien se utiliza para la amplificación del DNA recombinante. Esto hace que la mayoría de los vectores desarrollados para células eucarióticas son lanzadera o shuttle, poseyendo también orígenes de replicación y genes marcadores de E. coli además de los de sus células hospedadoras características.
Transformación mediada por Ca2+.
Las células con capacidad de ser transformadas (de captar DNA) se denominan competentes.
Esta transformación consiste en tratar la membrana del E.coli, que usualmente es muy impermeable, con Cl₂Ca a 0ºC de modo que queda afectada la pared celular y el DNA es capaz de adherirse a los sitios accesibles de dicha pared. Después un corto choque térmico a 42ºC favorece la incorporación del DNA. Las células se recuperan por incubación en un medio completo a 37ºC durante 1h antes de ser sembradas en el medio selectivo correspondiente. Sin embargo, con este método solo resultan transformadas un número tal de células que no supera el 1%.
Otros métodos se basan en transformar protoplastos en lugar de células completas de modo que se trata la pared celular con enzimas líticas y, a continuación los protoplastos obtenidos se ponen en contacto con el DNA en un medio en presencia de Ca⁺⁺ y de PEG. Finalmente, los protoplastos regeneran sus paredes en un agar semisólido dando lugar a células de levadura transformadas viables.
Electroporación.
Sirve tanto para células de mamífero o de plantas como para levaduras y bacterias. Consiste en un proceso físico que, de modo transitorio y por acción de un breve pulso eléctrico, permeabiliza las membranas tanto de células procariotas como eucariotas, al hacer que se formen poros en las mismas, permitiendo la entrada en la célula de moléculas de DNA grandes e incluso de partículas víricas.
Es un método bastante ineficaz puesto que de cada 1000 células, sólo una de ellas recibe el DNA. Según el tamaño de la célula se necesita mayor o menor voltaje de modo que cuanto más pequeña es la célula, mayor voltaje se necesita para que se formen los poros en la membrana. Cuando cesa el pulso eléctrico, los poros se cierran.
Lipofección.
Consiste en la utilización de liposomas capaces de unirse tanto al DNA como a la superficie celular, ambos cargados negativamente. Se utiliza mucho con células de mamífero. El DNA transferido no se integra en el genoma, sino que los genes se expresan de modo transitorio.
Microinyección.
Los sistemas de microinyección de genes en oocitos, huevos y embriones de animales permiten el estudio de los genes transferidos durante el desarrollo embrionario normal. Estos métodos permiten la introducción de cualquier DNA en cualquier célula sin necesidad de presión selectiva para mantenerlo si bien se necesita un equipamiento costoso y mucha práctica con la desventaja de que se pueden tratar un número reducido de células cada vez. Se utilizan también para introducir vectores plasmídicos en núcleos de protoplastos vegetales. La microinyección se realiza al microscopio con capilares de vidrio de diámetro entre 0,1 y 0,5 mm y con ayuda de un micromanipulador.
Biobalística.
Consiste en utilizar microproyectiles a velocidad supersónica para introducir ácidos nucleicos y otras sustancias en células o tejidos intactos. Es una tecnología aplicable a todo tipo de células, procariotas y eucariotas, e incluso orgánulos como cloroplastos o mitocondrias.
Los microproyectiles se sitúan en la superficie de un transportador macroscópico denominado macroproyectil, de polietileno, y son impulsados por una descarga o explosión de gas. El gas que recubre las células o tejido a bombardear se retira con una bomba de vacío ya que provoca deceleración de los microproyectiles. Se usa sobre todo el helio puesto que un gas ligero minimiza ese problema.
Fusión de protoplastos.
Consiste en la mezcla directa de protoplastos bacterianos portando un alto número de copias de un plásmido determinado de interés, con células de mamífero en cultivo. Después de la fusión de las membranas en presencia de PEG, el contenido de las bacterias pasa al citoplasma de las células eucariotas y el DNA plasmídico se transfiere al núcleo. Se obtienen muchas copias del DNA exógeno integradas en tandem en el cromosoma hospedador.
Esta técnica no sólo se usa para la transferencia de DNA plasmídico de una bacteria a una célula eucariota, sino que también se aplican a la transferencia, inter o intraespecífica, de material genético entre dos líneas celulares de bacterias, de levaduras o de microhongos filamentosos. Así es posible que se den fusiones múltiples entre líneas que sean naturalmente incapaces de conjugar. Las condiciones de incubación posteriores a la fusión deben, en este caso, permitir que se regenere la pared celular para obtener células híbridas viables, capaces de dividirse y de formar colonias. En las células híbridas resultantes se recombinan los cromosomas de las células originales y portarán, por tanto, algunas características de ambos progenitores. Esto es bastante útil cuando el carácter que se desea transmitir depende de un gran número de genes que pueden incluso presentar diferente localización cromosómica o también cuando no se dispone de sistemas de transformación o vectores para alguna de las especies implicadas.
4) Selección de colonias aisladas que porten moléculas de DNA recombinante.
Nos queda simplemente seleccionar aquellas colonias bacterianas que expresen nuestro DNA recombinante, lo podemos hacer detectando el gen o sus productos (RNA o proteína) o detectarlo por secuenciación del genoma de cada colonia.
Técnicas de detección de productos génicos:
Southern blot:
Consiste en extraer el DNA genómico, digerirlo con una endonucleasa de restricción, separar los fragmentos por electroforesis y transferirlos a un papel de nitrocelulosa o de nylon, tras la desnaturalización por tratamiento alcalino, el DNA se hibrida con una sonda marcada complementaria a parte de la secuencia clonada con lo que nos detecta su presencia.
Se denomina Northern blot a la misma técnica aplicada al RNA y Western o Inmunoblot a la misma técnica para las proteínas.
Secuenciación directa de fragmentos de DNA:
Método de Sanger.
Se basa en la síntesis enzimática a partir de un primer (cebador), de secuencia complementaria a una molécula de DNA molde, por acción de una DNA polimerasa que va incorporando, al extremo 3' de la cadena en crecimiento, dNTPs (2'-desoxinucleótidos, de los cuales uno debe estar marcado) y ddNTPs (2',3'-didesoxinucleótidos) que difieren de los anteriores en que les falta el grupo hidroxilo del carbono 3' del azúcar, esto significa que su incorporación impide la formación del enlace fosfodiester entre la cadena en crecimiento y el siguiente nuevo nucleótido.
Las moléculas del DNA molde pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble y desnaturalizadas por acción del calor o álcalis. La calidad del DNA se obtiene tras una gran purificación por centrifugación a través de gradientes de cloruro de cesio generalmente. La cantidad de moléculas de RNA se debe reducir al máximo ya que compiten efectivamente con las moléculas de DNA durante la reacción de marcaje terminal.
Los cebadores son oligonucleótidos de entre 15 a 30 residuos y que deben ser de secuencia complementaria a la molécula de DNA molde, y con el extremo 5' bloqueado para que la síntesis se dirija en dirección 3'.
Las DNA polimerasas suelen ser muy variadas. El fragmento Klenow de la DNA polimerasa de E.coli fue la primera en usarse y sirve para secuenciar fragmentos cortos de DNA.
Para conseguir lecturas de secuencias más largas, del rango de los 700-800 bases, se utilizan soluciones de terminación que lleven una relación de ddNTPs: dNTPs del orden de 1:30 frente a la relación 1:10 en una secuencia de lectura de 400-500 bases.
El proceso de Sanger se basa en una serie de pasos:
Desnaturalización de la molécula de DNA de cadena doble por procesos de calor y/o álcalis.
Hibridación del cebador con la molécula de DNA. Unos 2 minutos a 65ºC con el descenso gradual de la temperatura hasta los 30ºC.
Síntesis enzimática, siendo necesaria la DNA polimerasa y los 4 dNTPs, uno marcado, durante unos 5 minutos a temperatura ambiente.
Parada de la reacción de polimerización a 4 tubos que llevan cada uno de los ddNTPs, continuando la reacción otros 5 minutos a 37ºC. Así se consigue detener en un tubo la reacción a nivel de la adenina (tubo con el ddATP), guanina (tubo con el ddGTP), y así con los otros tubos.
Final de la reacción a 0ºC y desarrollo de la electroforesis en condiciones desnaturalizantes.
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Método de Sanger.
Las reacciones se cargan en un gel de poliacrilamida al 6% al que se le aplica un voltaje entre 1500-2000 voltios durante un par de horas. La concentración de acrilamida varía según la resolución que se desee (ej.solo de los 50 primeros nucleótidos la concentración oscila entre el 12-20%). Después de la separación electroforética y posterior revelado por autorradiografía, la longitud del fragmento observado es igual a la distancia entre el punto de corte y el punto de marcaje. La lectura de los geles se realiza del extremo 5' al 3'.
Método de Maxam y Gilbert
Se basa en la capacidad de determinadas sustancias de modificar específicamente bases de la molécula de DNA. El éxito del método depende de la especificidad de estas reacciones de rotura, las cuales se llevan a cabo en dos etapas: primero se realiza una modificación química de bases específicas y segundo esta base modificada es separada del azúcar con rotura de los enlaces fosfodiester 5' y 3'.
Los mecanismos químicos de las primeras reacciones son los siguientes:
G: Tratamiento con DMS (dimetil sulfato) metila al N7 de la guanina.
G+A: El ácido fórmico debilita las uniones entre A y G, protonizando los nitrógenos del anillo de las purinas.
C: En presencia de Cloruro sódico, la hidrazina sólo reacciona con citosina.
C+T: La hidrazina divide el anillo de T y C.
Una vez que la cadena de DNA se ha cortado, un solo fragmento es radioactivo ya que únicamente se ha marcado un extremo de la misma. Este tipo de secuenciación requiere el conocimiento del mapa de restricción del fragmento a secuenciar. Este método es óptimo para secuencias de DNA que tienen menos de 250 nucleótidos a partir del extremo marcado.
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Secuenciación química de Maxam y Gilbert
Las reacciones de este método conllevan problemas, los reactivos a usar deben llevar un control de calidad y se necesitan DNAs de gran pureza; razones por las que ha sido algo desplazado por el método enzimático, aunque es realmente útil para obtener información de secuencias de regiones internas de grandes insertos de DNA.
Secuenciación quimiolusciente.
Después de la electroforesis de los productos de la secuenciación biotinilados, éstos son transferidos y fijados a una membrana de nylon. Posteriormente son detectados mediante una reacción quimioluminiscente.
Estrategias de secuenciación.
Es importante al ir a secuenciar: el tamaño de la región a ser secuenciada, la exactitud de la secuencia requerida y las facilidades de las que se disponga.
El uso más frecuente de la secuenciación es para detectar nuevas mutaciones o para verificar la orientación y estructura de las construcciones de DNA recombinante.
Secuenciación Directa por delecciones seriadas o Nested deletions
Se obtienen, mediante exonucleasas, una serie de fragmentos cada vez más deleccionados que comienzan en un punto común mantiéndose el otor extremo de la molécula constante e internándose progresivamente dentro de la región a secuenciar. Las delecciones se ordenan por tamaño y se secuencian de tal forma que en sucesivas lecturas pueden obtenerse secuencias que se van solapando con las anteriormente obtenidas. Siempre se utiliza el mismo primer o cebador.
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Obtención de
delecciones seriadas.
Secuenciación Al Azar o Shot-gun
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Se secuencian
distintos fragmentos al azar y luego se introducen en el ordenador, el cual se
encarga de ensamblarlos. Luego se clonan los distintos fragmentos en un vector
para ser secuenciados posteriormente.
Fraccionamiento al azar de una molécula de DNA molde para
su posterior secuenciación.
Secuenciación por Paseo o Primer Walking
Las secuencias ya obtenidas se usan para diseñar nuevos primers o cebadores que nos permitan ir avanzando progresivamente a medida que avanza la secuenciación en el fragmento de DNA a estudio. Esto requiere la síntesis de muchos oligonucleótidos.
Secuenciación desde varios Ips o Puntos de Iniciación
Este método permite ahorrar mucho tiempo iniciando la secuenciación desde varios puntos a la vez. Después de haber obtenido los IPs, hay que obtener lecturas de gran extensión que nos permitan reducir: el número de oligocebadores necesarios, el número de reacciones enzimáticas, el número de sondas de DNA, la cantidad de secuencias solapadas y el número de geles necesarios de secuenciación.
Secuenciación por Hibridación o Sequencing by hibridization (SBH)
Esta técnica utiliza un grupo de sondas de oligonucleótidos cortos de secuencia definida para la búsqueda de secuencias complementarias sobre una gran hebra de DNA molde. El patrón de hibridación es usado luego para reconstruir la secuencia de DNA.
La metodología de hibridación se lleva a cabo uniendo las sondas de oligonucleótidos a una placa mediante síntesis dirigida por luz, marcándolos con fluorescencia y a través de los cuales se hace pasar el DNA molde a estudio.
Esta técnica nos permite detectar cambios de bases.